学习一代测序和二代测序的基础原理。

一代测序 - Sanger 测序

https://zhuanlan.zhihu.com/p/75408383

采用 ddNTP，均不含羟基，如果合成了一个 ddNTP之后，DNA合成过程就中止了。

一代测序需要4个 DNA 合成反应体系（A C G T 各一个），原理如下图

优点：

• 测序读长可达1,000bp
• 准确性高达99.999%

缺点：

• 成本高
• 通量低

二代测序

https://zhuanlan.zhihu.com/p/20702684

优酷视频

https://v.youku.com/v_show/id_XNzEzNzk1NTA0.html

二代测序目前的主流是 illumina 测序

建库

由于Illumina测序策略本身的问题，导致其测序长度不可能太长。

所谓的建库就是把基因组打断成一定长度的片段。

打断后，补齐末端，然后再3‘段添加一个碱基A，之后再加上 adapter

桥式PCR

这个看视频更形象一点。

最终就是在 flowcell 中 形成了一个具有完全相同序列的簇，一般叫 cluster

测序

这个也是看视频更形象一点。

它是边合成，边测序。

它用于测序的碱基有两个特殊的地方，一是脱氧核糖3号位加入了叠氮基团而不是常规的羟基，类似于一代测序的ddNTP，保证一次只能添加一个碱基；二是碱基部分添加了荧光基团，不同的碱基有不同的颜色。

在测序过程中，每1轮测序，保证只有1个碱基加入的当前测序链。这时候测序仪会发出激发光，并扫描荧光。因为一个cluster中所有的序列是一样的，所以理论上，这时候cluster中发出的荧光应该颜色一致。一个测序扫描图片如下：

然后洗脱多余的没有附着上的脱氧核糖和聚合酶，加入特殊试剂，将脱氧核糖3号位的—N2改变成—OH，然后切掉部分荧光基团，使其在下一轮反应中，不再发出荧光。

如此反复，测出所有reads每个位置的序列。

为什么Illumina测序会有长度限制呢

1. 测序时，经过长时间的PCR，会有不同步的情况。通俗一点讲，比如一开始1个cluster中是100个完全一样的DNA链，但是经过1轮增加碱基，其中99个都加入了1个碱基，显示了红色，另外1个没有加入碱基，不显示颜色。这时候整体为红色，我们可以顺利得到结果。随后，在第2轮再加入碱基进行合成的时候，就变成了，之前没有加入的加入了1个碱基显示红色，剩下的99个显示绿色，这个时候就会出现杂信号。当测序长度不断延长，这个杂信号会越来越多，最后很有可能出现，50个红，50个绿色，这时候我们判断不出来到底是什么碱基被合成。
2. 测序过程中，使用的碱基是特殊处理的，有一个非常大的荧光基团修饰。在使用DNA ploymerase的时候，酶的状态也会受到底物的影响，越来越差。

这一方面应该也说明了，每条 read 最开始的分型质量是最好的，越往后质量越差。